在前期“滤”见新知系列课堂中，我们系统梳理了除菌滤器的验证概念及验证主计划，本期将聚焦验证体系中的核心环节——细菌截留测试。细菌截留是过滤系统验证的关键部分，旨在确保除菌级过滤器在药品生产过程中的性能，通过此测试，可以有效管理风险并保证合规性。特别是在最终无菌过滤步骤中，细菌截留测试确保过滤器在恶劣条件下仍能有效工作，从而保护产品质量，满足监管要求。测试流程从初步确认细菌生存性开始，逐步评估细菌截留，并在最不利条件下评估过滤影响。最终，根据测试结果和过程参数，确认过滤器在制造商的工艺条件下能生成无菌滤出液。

本文主要探讨细菌截留实验的法规要求和实施策略，也会讨论实验前的准备工作，如调整工艺条件和挑战微生物以确保实验的有效性。重点介绍细菌截留验证的关键点，涉及滤膜测试、过滤前后考量、接收标准和调查程序。最后，概述法规指南近两年对细菌截留现场核查的关注焦点，包括微生物存活、膜片选择、灭菌模拟、压差和动态时间模拟，以及挑战水平的法规符合性。本摘要旨在为细菌截留实验提供深入理解及实践指导。

细菌截留实验法规及验证策略

在细菌截留实验中，验证策略需模拟实际工艺的最差条件，以证明除菌过滤器能在高浓度下产生无菌液体。实验包含生存性确认、回收率确认和过滤器截留能力确认。

根据GMP指南，实验前需确认微生物在工艺条件下的生存性，若受影响，可通过调整工艺条件、配方、挑战时间或更换微生物来解决。

细菌截留验证法规核心要点

通过实验室模拟工艺最差条件，证明除菌过滤器在10⁷CFU/cm²挑战下产出无菌液体。验证包含三大模块：

·生存性确认——确保微生物在药液中存活

·回收率确认——验证培养方法可靠性

·截留能力确认——实测过滤器除菌性能

为何必须做生存性确认？

“应尽可能将挑战微生物直接接种在药品中进行细菌挑战。但是药品和/或工艺条件本身可能会影响挑战微生物的存活力，因此在进行细菌截留实验之前，需要确认挑战微生物于工艺条件下在药品中的存活情况，以确定合理的细菌挑战方法，也即活度实验(生存性实验)”--- 《除菌过滤技术及应用指南》，NMPA, 2018年10月

当前液体无菌性的确认普遍采用微生物培养法，若待测液体自身具备抑菌或杀菌特性，其培养结果的有效性将无法确认，可能无法真实反映样本的无菌状态。因此，在启动正式验证前，必须开展微生物生存性确认，以确证目标微生物在该特定料液中能否存活并进行有效培养。

总结：若药液含抑菌/杀菌成分，将导致培养结果失效。提前确认微生物存活状态，是验证有效性的前提。

除菌过滤工艺验证策略决策树

来源：2023版GMP指南

从GMP指南决策树里我们可以看出在细菌截留试验前必须验证挑战微生物在目标产品和工艺条件下的生存性：若微生物可存活，则直接将其接种于产品中进行挑战试验；若无法存活，需使用该产品预处理待测过滤器（核心方法），随后采用经充分验证的替代溶液实施微生物挑战。

替代方案下进行微生物挑战实验有如下几种建议可参考：

a.调整工艺参数：修改（如降低）温度以适应微生物生存。

b.调整料液配方：改变pH或去除抑菌/杀菌成分（需评估并确保不影响产品关键属性或过滤器兼容性）。

c.限定挑战时间段：在微生物可存活的特定时间段内进行加菌挑战。

d.更换挑战微生物：选用从制剂中或环境监控分离、更能耐受产品或工艺的微生物。

细菌截留实验设计及方法

了解细菌截留的验证策略后，我们再来展开实验设计。细菌截留验证前需进行生存性和回收率实验，以确定挑战微生物在特定接触时长和温度条件下的LRV值（对数下降值）。如果LRV值≤1，微生物可存活于药液中，可采用直接方法进行过滤；若LRV值＞1，药液可能对微生物有抑制或杀菌作用，需采用模拟最差工艺条件的不加菌药液进行工艺模拟，并通过调整温度、pH值或冲洗系统以去除抑菌物质后再进行加菌挑战。

细菌截留试验装置示意图

细菌截留试验最差条件的考量

细菌截留试验的研究目的是模拟实际生产过滤工艺中的最差条件，过滤含有一定量挑战微生物的产品溶液或者产品替代溶液，以确认除菌过滤器的微生物截留能力。--- 《除菌过滤技术及应用指南》，NMPA, 2018年10月

在细菌截留实验设计中，需基于验证所需的最差条件原则，从四个维度论证关键参数：

a.药液性质：渗透压（高渗透压可能导致微生物收缩而提高穿透风险）、表面张力及离子强度等物理化学属性，需识别对截留效率影响最显著的条件。
b.工艺参数：操作压力、流速、时间、温度波动、液体压力、过滤方式及PUPSIT（使用前灭菌后完整性）等操作变量，应确认这些工艺的最差参数条件。
c.过滤器特性：选择低泡点滤膜作为挑战单元，并确保回收滤膜的微生物可培养性。
d.挑战微生物：采用缺陷短波假单胞菌（Brevundimonas diminuta）时，需通过标准化培养控制菌体形态及活性，使其穿透风险表征最差工艺条件。

细菌截留验证实施要点总结

法规指南对细菌截留现场核查要点

近两年法规机构对细菌截留现场核查的重点包括微生物生存性、低泡点膜片选择、灭菌程序的模拟、压差正确模拟、动态过滤时间模拟以及挑战水平是否满足法规要求。这些要点确保验证结果的真实性和有效性，避免因条件选择不当导致的法规不接受情况。

总结 

细菌截留实验在除菌过滤验证中有着关键作用，旨在通过模拟最恶劣条件来测试除菌过滤器的效能。本文阐述了验证过程中的三个核心步骤：确认微生物的生存性、回收率的确认，以及验证过滤器的截留能力。在实验启动前需准确评估微生物生存性的必要性，以及一系列策略，包括工艺的调整、配方的修改及选择合适的微生物，以确保实验的有效性和准确性。此外，我们还深入讨论了实验设计的考量因素，如滤膜的选择、液体类型以及压差控制等关键参数，旨在为滤器使用者提供一份全面且实用的细菌截留实验执行指南。

此外，艾里奥斯还提供设计和验证过滤系统的服务，旨在降低风险并满足行业标准，支持法规申报的数据包可靠性。这一系列服务和测试确保了药品制造过程中的无菌环境，符合法规和质量标准。

参考法规与指南

[1] 《药品GMP指南》（2023年修订）无菌制剂-上册；

[2] PDA Technical Report No.26 ，Revised 2008，Sterilizing Filtration of Liquids；

[3] EU Guidelines to Good Manufacturing Practice，Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal Products，2022；

[4] 《除菌过滤技术及应用指南》（国家药品监督管理局2018年第85号）。